[摘要] 目的：研究启膈散乙酸乙酯部位对食管癌Eca109细胞生长的影响及其作用机制。方法：
MTT法检测启膈散乙酸乙酯部位对食管癌Eca109细胞生长抑制作用，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，westernblot检测STAT3蛋白的表达量。结果：在10~100μg/ ml 范围内，不同浓度启膈散乙酸乙酯部位能有效抑制Eca109细胞增殖（P＜0.05）。用1.47μg/ml 、33.26μg/ml、76.52μg/ml的启膈散乙酸乙酯部位作用Eca109细胞48小时，用流式细胞仪检测细胞凋亡率明显增加，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），并且westernblot检测结果显示，随着药物浓度的增加，STAT3的表达量也降低。结论：启膈散乙酸乙酯部位能显著抑制食管癌Eca109细胞增殖，并诱导细胞凋亡，其作用机制与抑制STAT3信号通路有关。
[关键词]启膈散乙酸乙酯部位；食管癌；Eca109细胞；凋亡；流式细胞仪；STAT3
食管癌属于中医“噎膈”范畴，痰气交阻是噎膈发生的主要病机，痰气交阻证是其最常见证候之一。对1979年1月至2011年12 月中国期刊数据库( CNKI) 收录的中医诊治食管癌223篇文献进行研究发现，13个食管癌证型中，痰气交阻证占19.7%[1]。启膈散是行气化痰法治疗食管癌代表方剂，是清代名医程钟龄在他的《医学心悟》中为治疗噎膈所创制，原书说本方：“通噎膈，开关之剂，屡效。” 该方可通过PLC-γ1介导的信号转导通路抑制食管癌细胞生长，通过Caspase-3介导的细胞凋亡信号诱导凋亡[2,3]。
STAT3 （signal transducers and Activators of transcription,STAT3）是近年来研究异常活跃的信号转导及转录活化因子, 在人类多种肿瘤组织和肿瘤细胞株中呈高水平表达，高表达STAT3的肿瘤细胞依赖STAT3信号通路而存活, 当使用抑制剂选择性抑制STAT3活性即能够诱导肿瘤细胞的凋亡, 因此STAT3信号途径作为多种人类肿瘤干预治疗有效的分子标靶而被深入研究[4,5]。有研究发现，STAT3蛋白的表达与食管鳞癌的发生及癌细胞的浸润行为有关[6]，而启膈散作用后STAT3信号通路的研究鲜见报道，本实验研究启膈散作用Eca109细胞后，细胞增殖和凋亡情况，以及STAT3蛋白的表达情况，以探讨启膈散作用于食管癌的分子靶点。
1 材料与方法
1.1 试验药物
启膈散参照《医学正传》组方，药物组成与比例：丹参：沙参：茯苓：川贝母(去心) ：
杵头糠：砂仁壳：郁金=6：6：2：3：1：1：1；药材均购自北京同仁堂，经河南中医学院苗艳艳副研究员鉴定为真品。药量按照上述比例称取每味药物对等克数，重量：体积=1：
10 加入95%乙醇浸泡7天，每日震荡两次混匀。旋转蒸发，浓缩药液，上述浓缩液与乙酸乙酯体积比为2：1进行萃取，然后浓缩、低温真空干燥、刮药、称重，最终出膏率为0.82%（最终提取出的膏状药物重量/最初买的药物重量）。DMSO充分溶解配置100mg/ ml的母液，0.22μm过滤除菌，-20℃冰箱保存，备用。
1.2 细胞株 人食管癌癌细胞株Eca109，为河南中医学院分子生物实验中心保存。
1.3 试剂 RPMI1640 培养基（索来宝公司，批号：20131012），胎牛血清（杭州四季青公司，批号：121005），MTT 和胰酶（索来宝公司，批号：20131113）。Annexin V-FITC /PIApoptosis Detection Kits（凯基生物公司，凋亡试剂盒批号：20131226），STAT3 兔抗(美国Proteintech)，Bcl-2 兔抗(美国Proteintech)，Caspase9 兔抗(美国Proteintech)，山羊抗兔IgG(H+L)(美国Proteintech ，Cat.No.SA00001-2)，兔抗β- tublin（美国SANTA CRUZ），上样buffer（5×)（Boster 武汉博士德，Lot：09k06A12)，发光液(美国Millipore， Lot.No：
1409001)，蛋白定量试剂盒（北京Solarbio)。
1.4 仪器 细胞培养箱（德国 Heraeus BBD6220型），紫外分光光度计（美国Thermo公司Bionate100-240型），酶标仪（美国BIO-TEK SG-603 ELx800型），生物安全柜（美国BakerSG603型）,倒置显微镜（中国Motic公司AE31GAJG型），流式细胞仪 (美国BD，FACSCaliburFlow Cytometre型)。
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1.5 方法
1.5.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2的孵箱中培养细胞，每2~3天传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。
1.5.2 MTT 法检测启膈散乙酸乙酯部位对Eca109细胞的抑制率 按104个/孔的细胞密度接种96孔板中（96孔板周边孔弃去不用，加无菌PBS填充），每孔加200μl含10%胎牛血清的细胞悬液，将96孔板置于CO2培养箱中孵育24小时。弃去培养液，分别加入含不同浓度乙酸乙酯部位的培养液100μl，浓度为10、20、40、60、80、100μg/ ml，另设对照孔（加培养液100μl和与溶解药物等量的DMSO），每组设8个复孔。细胞培养48小时后，每孔加入5mg/ml MTT液15μl，继续培养4小时，吸去上液，然后向每孔加入150μl DMSO，轻轻振荡后，用酶标仪检测，570/630nm 处测各孔吸光值（OD值），用如下公式计算：细胞抑制率=（对照组OD值 - 实验组OD值）/ 对照组OD值?00%。重复5次。
1.5.3 流式细胞仪检测 观察含不同浓度启膈散乙酸乙酯部位对Eca109细胞凋亡的影响。
Eca109细胞按每孔105 /ml的密度接种于培养皿中，培养24小时，加入启膈散乙酸乙酯部位提取物的RPMI1640培养液，使药物终浓度分别为1.47μg/ml 、33.26μg/ml、76.52μg/ml，对照组加培养液与溶解药物等量的DMSO，细胞培养48小时，用不含四乙酸乙二胺（EDTA）的胰酶消化收集细胞，4℃PBS洗，离心收集，计105个细胞于流式管中，加结合液Buffer重悬细胞，然后加Annexin V-FITC，避光10分钟，再加PI避光5分钟，1小时内上机检测。用FACSCalibur Flow Cytometre型流式细胞仪进行检测，采用Cellquest软件获取数据、Modfit LM软件分析数据。重复4次试验。
1.5.4 westernblot检测STAT3、Bcl-2与Caspase9蛋白实验步骤参照参考文献[7] 。Eca109 细胞按每孔106·mL-1 的密度接种于培养皿中，培养24 小时后，加入含启膈散提取物的1640 培养液，使药物终浓度分别为药物终浓度分别为1.47μg/ml 、33.26μg/ml，对照组加含相同浓度的DMSO 的1640 培养液，细胞培养48 小时后，冰上收集全部细胞，4℃PBS 洗，离心收集，加入含苯甲基磺酰氟（PMSF）的总蛋白提取细胞裂解液，冰上裂解1h，15000rpm，4℃离心10min，取上清液，-80℃保存。根据目的蛋白STAT3、Bcl-2、Caspase9 蛋白与内参β-tublin 的分子量大小，配制合适的下层胶（10%）和上层胶（5%），分别将20ug 蛋白提取物和5×上样缓冲液4ul 混合，终体积为20μl，将蛋白样品95℃加热变性5 分钟后，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳、转膜实验，5%脱脂奶封闭膜4℃过夜，一抗室温摇床封闭2h，TBST 洗6 次，每次5 分钟；二抗室温摇床封闭1 小时，TBST 洗6 次，每次5 分钟，加入ECL（ECL 有发射极耦合逻辑电路的意思,在化学领域,是一种化学发光试剂）超敏发光液，全能型凝胶成像分析系统拍照并分析。
1.5. 5 统计学分析 实验数据以x__±s 表示，使用SPSS 17.0 数据统计软件进行方差分析，再进行LSD-t 检验，测P﹤0.05 有统计学意义，回归分析进行曲线拟合，应用概率法计算半数抑制率。
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2. 结果
2.1 不同浓度启膈散乙酸乙酯提取物对Eca109细胞的生长抑制作用 启膈散乙酸乙酯部位各浓度组作用Eca109细胞48小时，体外有一定的抑制作用，呈现一定的量效关系（图1，表1），回归分析法得R2=0.906，F=14.457, Y= - 3.179×10-5x2+0.008 x+0.288，根据概率法得IC50=33.26。
IC35=1.47， IC70=76.52。
表1 六君子乙酸乙酯部位对食管癌Eca9706 细胞的生长抑制（x__盨D，n=5）
Table 1 Effect of Qige San ethyl acetate extract at different concentrations on theproliferation of human esophageal carcinoma Eca109 cells组别 剂量（μg/ml） OD 值 抑制率（%）
对照组 对照 1.21125±0.11813 ----
启膈散乙酸乙酯部位 10 0.849±0.17743※※ 29.91启膈散乙酸乙酯部位 20 0.581±0.09272※※ 52.33启膈散乙酸乙酯部位 40 0.5277±0.07239※※ 56.44启膈散乙酸乙酯部位 60 0.4597±0.01405※ 62.05启膈散乙酸乙酯部位 80 0.3587±0.1009※※ 70.39启膈散乙酸乙酯部位 100 0.262±0.06295※※ 78.37※：与对照组相比P<0.05.；※※：与对照组相比，P<0.012.2 启膈散乙酸乙酯部位对Eca109 细胞诱导凋亡的作用 用启膈散乙酸乙酯部位的高、中、低即1.47μg/ml 、33.26μg/ml、76.52μg/ml 三个浓度，抑制率分别为：35%、50%、70%，作用于Eca109 细胞48 小时后，处理组与对照组比较，凋亡明显增加，流式细胞仪检测结果如下：差异具有统计学意义（P<0.001，n=4）（表2）。
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