抗体类生物治疗药物活性测定方法

    【摘 要】目的:对抗体类生物治疗药物活性测定方法进行研究分析。方法:通过基于细胞的生物活性测定方法、基于新技术的生物学活性测定方法、生物学试验的统计方法来进行分析与研究。结果:基于细胞的生物活性测定方法有细胞增殖抑制法、细胞毒性法、补体依赖的细胞毒法、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性法、这几个方面。基于新技术的生物学活性测定方法有表面等离子共振效价测定法、均相时间分辨荧光、 Alpha技术、荧光染料标记法这几种。结论:越来越多的新型技术用于单抗药物的活性检测，为抗体药物的质量提供了新的保障，对国内抗体药物研发企业在质量控制尤其是活性测定方面具有重要的指导作用和参考价值。

    【关键词】抗体类生物治疗药物；活性；测定方法

    抗体类生物治疗药物的活性测定在质量控制中至关重要。目前抗体药物的活性分析方法主要是体外( in vitro) 检测，其中基于细胞的分析方法由于其具有操作简便，周期短，特异性好，变异度小等优点得到广泛应用。为了获得反应性理想的细胞和简便易行的检测方法，构建转基因细胞成为目前常用的策略之一。此外，一些新型技术也快速应用于抗体类药物的活性评价中。

    1 资料

    结合抗体类生物治疗药物活性测定方法的现状以及发展趋势，主要从基于细胞、转基因细胞以及新技术应用三方面对抗体药物活性测定方法进行简要综述，为抗体药物的研发和质量控制提供新思路。

    2 方法

    2.1 基于细胞的生物活性测定方法

    2.1.1 细胞增殖抑制法

    针对生长因子靶点的抗体药物多是采用细胞增殖抑制的方法来反映抗体的生物学活性，包括抗血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)单抗[1]、抗人表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，HER2)单抗及抗人表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR或HER1)单抗等。其中抗VEGF单抗的经典测活方法是人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)增殖抑制法，即在刺激因子VEGF存在的情况下，抗VEGF单抗能够以剂量依赖性的方式抑制HUVEC细胞的增殖。抗HER2单抗的活性测定通常选取HER2阳性的乳腺癌细胞，如BT474、SK-BR-3、SKOV3[2]等作为靶细胞，抗体与靶细胞表面HER2抗原结合后，能够有效抑制细胞生长信号传递，从而抑制细胞增殖。抗EGFR靶点单抗也是通过特异结合并封闭表皮生长因子受体，有效抑制肿瘤细胞生长，如DiFi细胞、A431细胞增殖抑制法等。

    2.1.2 细胞毒性法

    细胞凋亡有两条途径，一是线粒体依赖途径，另一个为死亡受体介导途径。肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)[3]和受体结合后，可启动死亡受体介导途径，使procaspe-8自我水解、活化，形成活性caspase-8，后者再激活caspase3、6、7等，引起下面的级联反应，导致细胞发生凋亡。重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的活性测定可以利用其能够抑制TNF-α所引起的敏感细胞系U-937中caspase3/7活化。

    通过Caspase-Glo3/7检测试剂盒中萤光素酶发光信号的改变来反映该制品的活性。此外，针对TNF-α的单抗还可以采用对TNF-α杀伤敏感的细胞系，如小鼠成纤维细胞L929、小鼠纤维肉瘤细胞WEHI164等，抗体能够抑制TNF-α所诱导的细胞凋亡作用，通过检测细胞存活的染色来评价抗体的生物学活性。在细胞存活相关染料的选择上，包括结晶紫、MTT、MTS、CCK-8等在内的染料具有各自的优缺点。

    结晶紫是一种三苯甲烷类染料，常用作生物染色剂和无机离子的显色剂。其染色过程虽然相对简单，但是不能区分死活细胞，只能反映细胞数量。而MTT作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水不溶性的橙黄色甲臜产物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，因此可间接反映活细胞数量，但MTT还原产物不溶于水，需被溶解后才能检测。MTS还原产物是水溶性的甲臜，无需洗涤和溶解步骤，使用更方便，重复性优于MTT[4]。而CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中，溶液相当稳定，对细胞没有毒性，可长时间孵育，是用于测定细胞毒性或细胞增殖试验中活细胞数目的一种简便快速、灵敏度高、重复性好的染料。

    2.1.3 补体依赖的细胞毒法

    单抗药物与靶细胞表面分子结合后，可介导补体C1q结合到抗体的Fc段，并于肿瘤细胞膜上形成类似于穿孔素效应的攻膜复合体(membraneattackcomplex，MAC)[5]，造成细胞外离子大量内流，最终导致肿瘤细胞的溶解。CDC生物学活性测定中一个的关键环节是补体的选择及对其质量的控制，补体组分多，且热不稳定，容易失活，目前所用的补体来源包括正常人血清、豚鼠、家兔等，来源复杂、剂型不同，因此在CDC实验中需要考虑补体效力、稳定性，尽量减少活性测定反应终点和测定结果的变异[6]。以CD(clusterofdifferentiation)分子为靶点的单抗药物，如抗CD20单抗、抗CD52单抗等，其生物学活性评价方法主要为CDC活性测定，即将重组抗体进行系列稀释后与高表达相应CD抗原的靶细胞结合，在补体存在的情况下，抗体与细胞表面抗原形成抗原抗体复合物，激活补体经典活化途径，完成攻膜复合物的装配并在细胞表面打孔，最终导致细胞溶解。利用上述检测细胞存活的染料可以对抗体的CDC作用效果进行评价。

    2.1.4 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性法

    单抗药物通过Fc段介导的免疫效应除了CDC作用外，另外一个重要的效应即是抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。传统的ADCC检测方法多为基于新鲜制备的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)或者自然杀伤细胞(naturalkiller，NK)作为效应细胞的杀伤试验，以上方法存在细胞分离和培养困难、变异大、操作繁琐、高背景值等缺陷。研究表明，在NK细胞中Fc受体(FcR)活化[7]，尤其是FcRγIIIa受体(CD16)活化能够引起NFAT(nuclearfactorofactivatedT-cells)信号通路的激活。近年来基于报告基因法已建立了稳定而可靠的抗CD20单抗的转基因细胞ADCC评价方法。

    该方法以WIL2-S细胞系(人B淋巴细胞)作为靶细胞，使用工程改造的Jurkat细胞作为效应细胞，该细胞稳定表达了FcγRIIIa受体和由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告基因。当高表达CD20抗原的靶细胞与表达FcγRIIIa受体的Jurkat细胞通过抗CD20单抗桥联时，可引起NFAT荧光素酶报告基因的活化，通过检测荧光素酶化学发光信号来反映抗体的ADCC效应[8]。

    该方法操作简便易行，专属性强、重复性好、准确性高，可作为抗CD20单抗ADCC生物学活性的常规检查方法，用于评价包括人鼠嵌合单抗、人源化单抗、全人源单抗和糖基化改造单抗在内的各类抗CD20单抗的ADCC活性;更重要的是该方法可用于评价糖基化修饰与抗CD20单抗功能的关系，这也为该类制品工艺稳定性评价及结构与功能关系研究奠定基础。

   2.2 基于新技术的生物学活性测定方法

    2.2.1 表面等离子共振效价测定法

    表面等离子共振现象是发生在两种折射率不同的介质界面上的一种光学现象，最早于1902年由Wood发现，并由Otto和Kretschmann等在1968年对其原理进行了详尽的阐述。简单而言，当光源的一束入射光从高折射率介质(如玻璃)射向低折射率介质(如溶液)的界面时，如果入射角大于一定的临界角，入射光将会被100%地反射至光源的同一侧，这叫做全内反射现象。当两种介质之间有一层极薄的金属膜(最为常见的50nm金膜)，这时入射光的能量将会引起金膜中等离子体的共振并以一种电磁场(称作消逝波)的方式弥散至低折射率介质一侧(如溶液)[8]，从而导致反射光的能量在某个特定的角度降至最低，这一角度被称作SPRdip角。

    表面等离子共振作为一种生物传感器技术广泛地应用于分子相互作用分析领域，当分子间发生结合或者解离时，会定量改变金膜表面附近分子的浓度，从而导致金膜附近折射率的变化，进而导致SPRdip角的改变，通过实时监测SPRdip角度的变化，就可以实时分析分子间的结合与解离过程。该技术无需预先标记荧光、二抗的分子，避免了标记基团对分子构象的影响，从而反映出分子间真实的结合性质;该技术样品消耗量低，一般仅有微克级;除了获取一般的亲和力信息外，还能够给出对阐述分子间结合机理更为宝贵的动力学信息。SPR技术已广泛应用于小分子制药和生物制药领域。

    2.2.2 均相时间分辨荧光

    均相时间分辨荧光是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法，也是用来研究药物靶标的理想平台。

该技术结合了荧光共振能量转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET)和时间分辨荧光(Time-ResolvedFluorescence，TRF)两种技术。这种结合将FRET的均相实验方式和TRF的低背景特点融合在一起，使得HTRF技术拥有操作简单、灵敏度高、通量大、实验数据稳定可靠、假阳性率较低的优势。在HTRF实验中，当供体和受体相离很近时，在供体和受体之间会有荧光共振能量转移而产生信号。采用双波长检测能够显著减小缓冲液和培养基的干扰，最终的信号与产物形成的量成比例。HTRF技术进入药物研发领域以来，加快了很多基于抗体的研究，HTRF技术也可以取代大部分ELISA，因为HTRF具有同等的检测范围和检测极限，而且更节省实验时间，并且不需要洗板的步骤，所以该技术近年来已被应用于抗体的活性检测。例如，抗肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)[10]单抗的结合活性测定就是一种竞争性抑制受体-配体结合的效价测定。

    通过镧系元素螯合物均相时间分辨荧光法(LANCEHTRF)测定抗HGF单抗与HGF结合，并阻止HGF结合至其受体的能力。在测定中，将铕标记的HGF受体(hu-HGFR-Eu)结合至生物素标记的HGF(biotin-huHGF)，后者结合至链霉亲和素-别藻蓝蛋白(SA-APC)。该结合诱导铕和APC分子接近，而使荧光发生共振能量转移，通过具有检测HTRF功能的酶标仪进行检测。抗HGF单抗能够抑制biotin-huHGF结合至hu-HGFR-Eu，并阻止能量转移，因此降低了荧光信号输出，即抗体的量与产生的荧光量呈负相关。

    2.2.3 Alpha技术

    该技术既可用于检测细胞内各个Biomarker，也可进行各类分子相互作用研究，简单可靠。近年来，Alpha技术也应用于抗体的活性检测，该技术主要含有两种微珠，一种为供体，另一为受体。当供体微珠所带有的抗原分子(A)与受体微珠所带有的抗体分子(B)距离非常接近时，可以使用680nm激发光去引发其表面所带有的光敏感物质，使其催化周围的氧分子形成活化态，产生效率可达每秒60000个氧分子活化态产生，借此将讯号放大，此活化态氧分子再与邻近的受体微珠上的二甲基噻吩化合物产生化学冷光反应，产生冷光效应(波长大约370nm)，此冷光进一步借由能量转换激发让受体微珠产生520～620nm的发散光荧光信号，由于氧分子活化态非常不稳定，此反应相当快速仅4μs，加上若此二种微珠距离超过200nm，反应随之下降，所以只有抗原抗体分子结合才能触发反应，通过测定荧光量来反映抗体的活性。

    2.2.4 荧光染料标记法

    荧光染料标记法具有灵敏度高、选择性高、方法简便快捷、样品用量少等优点，已经广泛地应用于生物、化学、医药、卫生、农业、环境保护等领域中。应用在抗体活性检测中，荧光染料可以标记分子或细胞。

    2.2.4.1 荧光染料标记细胞

    荧光染料作为荧光检测分析方法的载体，其性能的优劣直接决定了检测方法的可行性及灵敏性。Calcein-AM(钙黄绿素-AM)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性。因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内，发出强绿色荧光。

    与其它同类试剂(如BCECF-AM和Carboxy-fluoresceindiacetate)相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去标记活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein(钙黄绿素)不会抑制任何的细胞功能，如增殖或趋化性等。

    2.2.4.2 荧光染料标记分子

    BODIPY(氟化硼二吡咯)类荧光染料作为一类新型的荧光染料，因其良好的光物理性质，在过去的二十年内得到广泛的研究。与其它的荧光染料相比，BODIPY类荧光染料具有较窄的吸收和发射峰、较高的摩尔吸光系数、较高的光稳定性和化学稳定性以及较高的荧光量子产率等。

    例如，抗PCSK9单抗的的生物活性测定即是用BODIPY标记的低密度脂蛋白(LDL)通过HepG2细胞来测定其生物活性。PCSK9是前蛋白转化酶枯草溶菌素9，能与低密度脂蛋白受体(LDLR)直接结合，促使LDLR内化和降解。降低肝细胞上LDLR的数量能够降低肝脏从循环中清除LDL的能力。抗PCSK9抗体能够与PCSK9结合，阻滞PCSK9与LDLR结合，增加LDLR数目，从而增加HepG2细胞中BODIPY标记的LDL荧光量。

    2.3 生物学试验的统计方法

    分析在生物活性的定量测定中，一般有两种反应类型，一种是直线性反应，另一种是曲线性反应。关于选择何种拟合模型和统计学分析软件更合适的问题，主要从反应的实际曲线、拟合优度和简便性三个方面考虑。目前美国药典(UnitedStatesPharmacopeia，USP)、欧洲药典(EuropeanPharmacopeia，EP)等比较常用的统计学分析软件包括UNISTAT、CombiStats、StatLIA、PLA、4-Parameter等。PLA2.0是一个不受硬件约束的，商业化的生物学分析软件。它是Stegmannsystem的主要产品，目前有200余家公司在GMP环境下使用该软件。该软件基于欧洲药典5.3版、美国药典和其他科学出版物。StatLIAQuantum统计软件在使用规模，数据储存，可使用范围，统计分析，人性化报告上具有很好的优势，可用于活性检测、定量检验、免疫原性质量筛选等方面。

    CombiStat软件是由EDQM(EuropeanDirectoratefortheQualityofMedicines＆HealthCare)研发，包括平行线分析、四参数和五参数、sloperatiomodel、probitmodel等，在欧洲应用广泛。我国研发单位对于生物学活性的评价应用四参数(4-Parameter)模型拟合的较多，其数据呈典型的S型曲线，可反映出上下渐近线、EC50值和斜率等指标。USP、EP等国外药典都强调生物统计在生物学试验中的应用及其重要性，尤其是在数据类型和分析模式、数据采集、稳定性试验和离散度的选择方面对于生物学试验的设计和发展至关重要。然而统计学分析手段在2010年版《中国药典》三部治疗性生物制品活性测定中的应用是总体基本缺失的，这个问题在未来应充分重视。

    3 结论

    总而言之，分子生物学的快速发展和细胞信号通路的深入研究促进了基于细胞的生物活性测定方法的发展，而转基因细胞法特别是报告基因法的建立能更加快速、灵敏地反映抗体的生物学活性。越来越多的新型技术用于单抗药物的活性检测，可以实现对抗体药物进行精准、多方位、动态的分析，为抗体药物的质量提供了新的保障，对国内抗体药物研发企业在质量控制尤其是活性测定方面具有重要的指导作用和参考价值。    　　【参考文献】

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