樱桃菌根真菌分离培养条件及有效性(2)

　　1.2.2 最适温度的测定 采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入最优培养基中，每个梯度3次重复，将培养基分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃的环境下培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。

　　1.2.3 最适pH的测定 将最优培养基用1 mol/L HCl和1 mol/L NaCl调节pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11（pH为2、3的培养基将琼脂量提高1倍，使其凝固），采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入不同pH的培养基中，每个梯度3次重复，在恒温25 ℃培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。

　　1.2.4 最适P浓度的测定 将最优培养基的KH2PO4和K2HPO4调节至（0.25，0.5）、（0.5，1）、（0.75，1.5）、（1，2）、（1.25，2.5） g/L，保持pH为最优值，采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入不同P浓度的培养基中，每个梯度3次重复，在恒温25 ℃培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。

　　1.2.5 最适C源的测定 将最优培养基的C源分别利用20 g/L的葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖替代，采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入不同C源的培养基中，每个梯度3次重复，在恒温25 ℃培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。

　　1.2.6 最适N源的测定 将最优培养基的N源分别利用15.75 g/L蛋白胨、15.75 g/L牛肉膏、2.36 g/L尿素、 4.21 g/L NH4Cl、 7.95 g/L KNO3替代（保证N含量一致），采用打孔法， 在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入不同N源的培养基中， 每个梯度3次重复，在恒温25 ℃培养4 d， 采用十字交叉法测量菌落直径。

　　1.2.7 有效性检测 将最优培养基中的菌根放入麸皮培养基进行菌根真菌活化。培养7 d后，将麸皮培养基低温烘干后，均匀加入100棵处于炼苗期的樱桃苗的培养土中，同时取100棵长势相同的樱桃苗作对照。培养45 d后，测算成活率和根系侵染率，侵染率采用台盼蓝染色法和格线交叉法测定[10]。

　　1.3 数据分析

　　试验数据用Mirosoft Excel 2007进行统计分析。

　　2 结果与分析

　　2.1 处理时间和培养基种类的影响

　　从图1可以看出，在处理时间一致的情况下，MMN培养基感染杂菌量显著少于PDA、PDA-抗生素培养基；同一种培养基随处理时间的延长感染杂菌量逐渐减少，其中处理时间4、6、8 min感染杂菌的减少量不显著，MMN培养基处理时间6、8 min感染杂菌量相同。从图2可以看出，在处理时间一致的情况下，MMN培养基长菌量显著高于PDA、PDA-抗生素培养基，其中当处理时间为4、6 min时长菌量较多。综合图1、图2数据发现，当MMN培养基在处理时间为6 min时，既能有效抑制杂菌的生长，又能使长菌量达到较高水平。

　　2.2 不同温度对菌落直径的影响

　　从图3可以看出，当温度为5 ℃时，菌根真菌菌落停止生长。随着温度升高，菌根真菌的菌落直径逐渐增大，当温度升高到25 ℃时，菌落直径达到最大，为原来的4.71倍。当温度继续升高时，菌落直径开始逐渐减小。数据表明，温度对菌根真菌生长影响显著。

　　2.3 培养基pH对菌根真菌生长的影响

　　由图4可以看出，当pH 2时，菌根真菌停止生长。随着pH的增大，菌根真菌的生长速度逐渐提高，当pH达到7时，菌落直径最大，为4.98 cm。当pH继续增大时，菌落直径开始缓慢减小。当pH为5～10时，菌落直径变化不明显，表明pH对菌根真菌的生长影响在一定范围内不显著。

　　2.4 培养基P浓度对菌根真菌生长的影响

　　图5表明，在不同浓度P条件下，菌落直径存在一定差异，但总体差异不大。当KH2PO4和K2HPO4分别为0.50 g/L和1.00 g/L时，菌落直径最大。

　　2.5 培养基C源对菌根真菌生长的影响

　　由图6可以看出，在不同C源条件下，菌落直径存在显著差异，其中当C源为葡萄糖时，菌落直径最小；当C源为可溶性淀粉时，菌落直径最大，比C源为葡萄糖时的菌落直径大0.43 cm。数据表明，不同C源对菌根真菌菌落直径的影响存在差异。

　　2.6 培养基N源对菌根真菌生长的影响

　　从表1可以看出，在不同N源条件下，菌落直径差异较为明显。当尿素为N源时菌落直径达到最大，当氯化铵为N源时，菌落直径最小。数据表明，不同的N源对菌落直径产生不同的影响。 

　　2.7 菌根共生体系建立

　　通过对樱桃苗根系侵染率及植株成活率进行检测，结果表明，施加菌根真菌的根系侵染率为27.1%，对照组为0；施加菌根真菌的植株成活率为86%，高于对照组的73%。分析结果可知，该菌根真菌经过分离培养仍具有一定的有效性，可以显著提高植株的成活率。

　　3 讨论

　　通过用PDA培养基、PDA-抗生素培养基、MMN培养基分离该菌发现，三者对该菌的分离具有明显差异。其中，MMN培养基可以有效减少杂菌的感染量，而PDA培养基和PDA-抗生素培养基杂菌感染量均较高，并且MMN培养基能够明显促进该菌的生长，具体作用机理有待进一步研究。HgCl处理时间对根系感染具有明显的抑制作用，其在6 min内能明显减少杂菌感染量，当超过6 min时，这一作用不太明显。与此同时，处理时间也影响该菌的生长，在处理时间较短时，由于杂菌较多会直接影响到该菌的生长，随着处理时间的延长，杂菌感染量减少，促进该菌生长，但过长的处理时间可能会杀死根系内部的真菌孢子，导致该菌生长减缓。