[摘要] 为了建立丹参毛状根的诱导方法及液体培养体系，以发根农杆菌A4，LBA9402，15834为试验菌株分别侵染丹参无菌苗叶片，诱导丹参毛状根，PCR扩增筛选阳性株系，HPLC测定丹酚酸含量并在此基础上进一步优化毛状根的液体培养条件。结果显示：3种发根农杆菌A4，LBA9402，15834均诱导出丹参毛状根，经PCR鉴定证明其Ri质粒T-DNA均已整合到丹参基因组中，其中发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根丹酚酸含量较高，质量分数分别为（3.27±0.37）%，（3.17±0.20）%；由发根农杆菌LBA9402诱导MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量较高，质量分数为（4.56±0.36）%；由发根农杆菌LBA9402诱导，pH为4.81的MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量最高可达4.85%。因此，以发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根在pH为4.81的MSOH液体培养基中培养的丹酚酸含量较高。为进一步利用基因工程技术改良中药丹参的品质奠定了基础。
[关键词] 丹参毛状根；发根农杆菌；丹酚酸；HPLC
中药丹参是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根或根茎，具有祛瘀止痛、养血安神的功效[1]。现代药理研究表明丹参对治疗心血管系统和血液系统的疾病有显著的作用，现已广泛使用临床[2]，其药效物质基础主要是脂溶性二萜醌类成分和水溶性酚酸类成分[3]。
由于丹参有效成分在原植物根中含量低、生长周期长，在传统的栽培模式下又面临着品质严重退化、农药残留及占用大量耕地资源等问题，利用基因工程的手段对丹参品质进行遗传改良是一条理想的途径。由发根农杆菌感染植物形成的丹参毛状根系统，生长速度较快，遗传性稳定，成为生产丹参药理活性物质尤其是水溶性酚酸类成分的良好培养系统[4]。目前，国内外围绕丹参毛状根的研究工作已有一些成果[5-9]，但是关于通过优化丹参毛状根的诱导及培养条件来获得高含量有效成分尚无报道。本文对影响丹参毛状根有效成分的多种因素进行了研究，为丹参的遗传改良工作奠定了基础。
1 材料
丹参无菌苗（1/2MS固体培养基培养）取自本实验室，发根农杆菌菌株A4，LBA9402，15834由本实验室提供。1/2MS培养基是指在MS培养基的基础上除蔗糖外其余成分均减半，MSOH培养基是指在MS培养基的基础上由1 g·L-1水解酪蛋白替代NH4NO3。
Agilent 1260高效液相色谱仪冷，冻干燥机（美国Labconco公司），电子天平（Sartorius公司），丹酚酸B对照品（上海融禾医药科技发展有限公司，批号100429），迷迭香酸对照品（上海中医药大学标准化中心，纯度99.07%），乙腈（色谱纯，Fisher公司），其余试剂为分析纯，高纯水为本科室自制。
2 方法
2.1 发根农杆菌对丹参毛状根丹酚酸含量影响
2.1.1 发根农杆菌的培养与活化 发根农杆菌菌株为A4，LBA9402，15834。无菌条件下，接种针挑取保种菌液，于YMB固体培养基（含利福平50 mg·L-1，琼脂质量浓度10 g·L-1，pH 7.0）上划线培养，28 ℃暗室培养直至长出单菌落。挑取单菌落转入3 mL YMB液体培养基（含利福平50 mg·L -1）中，28 ℃，220 r·min-1震荡暗培养，至YMB液体培养基由接种前透明的暗红色变为浑浊的淡黄色，按1%转入新配制的无抗生素的30 mL YMB液体培养基中，28 ℃，220 r·min-1震荡暗培养，至A600为0.5。
2.1.2 丹参毛状根的诱导 从丹参无菌苗上取下幼嫩叶片，将叶片剪成1 cm2大小的叶盘；将上述菌液稀释2倍做侵染，将叶盘放入农杆菌悬液中浸5 min后，无菌滤纸吸去叶盘上多余的农杆菌，叶盘背面向上放在MSOH培养基上，用封口膜封上。25 ℃暗培养2 d，然后将叶盘以同样的方向转至含有500 mg·L-1凯福隆的脱菌MSOH固体培养基上，用封口膜封上后25 ℃暗培养。2周左右，在叶盘切口周围长出毛状根。待毛状根生长到2 cm左右时剪下转移到含有500 mg·L-1凯福隆的MSOH固体培养基中培养；3～4周后将毛状根转移到含有250 mg·L-1凯福隆的MSOH固体培养基中培养；2～3周后可转移到不含抗生素的MSOH液体培养基中培养。除菌完全的毛状根在无抗生素的MSOH液体培养基上继代培养，每21 d转接1次。
2.1.3 丹参毛状根rolB基因和rolC基因的PCR检测 将转接约3代的丹参毛状根收集材料，CTAB法提取各毛状根株系及未转化的丹参无菌苗的基因组DNA。另各取200 μL活化的发根农杆菌A4，LBA9402，15834菌液，12 000 r·min-1离心2 min，去上清，20 μL ddH2O悬浮，沸水煮5 min，12 000 r·min -1离心2 min，上清作为模板。上海赛百盛生物技术有限公司合成rolB基因和rolC基因的PCR引物， rolB-F：5′-CTTATGACAAACTCATAGATAAAGGTT-3′，rolB-R： 5′-TCGTAACTATCCAACTCACATCAC-3′；rolC-F： 5′-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3′，rolC-R： 5′-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3′。PCR反应体系：在20 μL PCR反应液中，分别加入rolB基因和rolC基因的上、下游引物各0.5 μL（终浓度25 pmol·L-1），模板DNA 2 μL（约50 ng）。PCR反应条件及过程：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s；72 ℃复性45 s （2～4步30个循环），72 ℃延伸10 min，4 ℃恒温保存。各取10 μL rolB基因和rolC基因的PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳和拍照，100 bp Ladder和1 kbp Ladder作为分子量标准。预期产物大小rolB基因和rolC基因分别为862，574 bp[10]。
2.1.4 不同发根农杆菌诱导的丹参毛状根丹酚酸含量测定 经PCR鉴定，发根农杆菌A4，LBA9402，15834分别获得了5，10，6株丹参毛状根阳性株系。将阳性株系均以每100 mL培养基1 g（鲜重）接种，MSOH液体培养基培养21 d后收取材料。分别收集了第4，5，6，9，10共5代材料于-80 ℃保存，冷冻干燥机冻干，置于电子干燥器中储存备用。
对照品溶液的制备：精密称取丹酚酸B对照品2.4 mg，加70%甲醇和1%甲酸制成1.2 g·L-1的丹酚酸B（SAB）对照品溶液；精密称取迷迭香酸（RA）对照品1 mg，加70%甲醇和1%甲酸制成0.5 g·L-1的迷迭香酸对照品溶液。
供试品溶液的制备：样品研磨成粉，将由同种发根农杆菌诱导的相同代数的丹参毛状根粉末等量混匀。精密称取混匀粉末50 mg，精密加入70%甲醇和1%甲酸10 mL，超声40 min。每个样品重复3次。
色谱条件：CNW C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长280 nm，柱温25 ℃，流速1.0 mL·min-1，进样量20 μL，流动相为乙腈（A）和0.4%甲酸（B）梯度洗脱：0～40 min，A 10%～37%，B 90%～63%。
2.2 培养基对丹参毛状根丹酚酸含量影响
丹参毛状根的培养：根据2.1实验结果，任取1瓶由LBA9402诱导的丹参毛状根（记为LBA9402-1）以每100 mL培养基1 g（鲜重）分别接种到pH为5.86的MSOH，MS，B5，6，7-V 4种液体培养基中，每个样品重复3次，于120 r·min-1摇床上避光培养，21 d后收取材料，这为第1代材料，记为MSOH-1，MS-1，B5-1，6，7-V-1。以同样培养条件继代培养并收集这4种培养基培养的第2，3，4，5，6共6代材料储存于-80 ℃冰箱中，然后置于冷冻干燥机中冻干，并储存于电子干燥器中备用。
供试品溶液的制备：样品研磨成粉，将由相同培养基培养的同代数的3瓶丹参毛状根粉末等量混匀。精密称取混匀粉末50 mg，精密加入70%甲醇和1%甲酸10 mL，超声40 min。每个样品重复3次，丹酚酸含量测定方法如2.1.4所示。
2.3 pH对丹参毛状根丹酚酸含量影响
根据2.1和2.2实验结果将由LBA9402诱导的MSOH液体培养基培养的丹参毛状根以每100 mL培养基1 g（鲜重）接种到不同pH的MSOH液体培养基中培养，每个样品重复3次，培养21 d后收取材料并于-80 ℃冰箱中保存。将收集的所有材料放于冷冻干燥机中冻干并置于电子干燥器中储存备用。
供试品溶液的制备：样品研磨成粉，将由相同pH培养的3瓶丹参毛状根粉末等量混匀。精密称取混匀粉末50 mg，精密加入70%甲醇和1%甲酸10 mL，超声40 min。每个样品重复3次，丹酚酸含量测定方法如2.1.4。
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