丹参毛状根的诱导及培养条件的优化(2)
3 结果与结论
3.1 不同发根农杆菌对丹参毛状根丹酚酸含量影响
3.1.1 丹参毛状根的诱导 将发根农杆菌A4，LBA9402，15834感染后的外植体接种于MSOH培养基上培养4～5 d后，有的外植体开始膨大，在伤口处产生少量的淡黄色愈伤组织。8 d后，3种外植体都陆续长出白色的毛状根，经脱菌完全后转到无抗生素的MSOH液体培养基中培养，LBA9402诱导的丹参毛状根诱导发生过程见图1。采用A4，15834侵染时，毛状根诱导发生过程与之类似。
3.1.2 丹参毛状根阳性株系的鉴定 rolB基因和rolC基因是发根农杆菌Ri质粒TL-DNA与毛状根的形态发生及再生植株形态特征密切相关的基因。分别以未转化丹参无菌苗基因组DNA、发根农杆菌15834，A4，LBA9402所诱导的丹参毛状根基因组DNA及其相应的菌株Ri质粒的DNA为模板，进行PCR检测，预计扩增产物大小rolB基因和rolC基因分别为862，574 bp。PCR检测结果表明，未转化丹参无菌苗基因组DNA中没有扩增出目的条带，转化毛状根中扩增出了预期的862，574 bp的特异片段，阳性率为100%，见图2。说明发根农杆菌T-DNA上rolB基因和rolC基因已整合进毛状根基因组中。
3.1.3 不同发根农杆菌诱导的丹参毛状根丹酚酸含量测定 将获得的丹参毛状根阳性株系在MSOH液体培养基（水解酪蛋白1 g·L-1，pH 5.85）中培养，HPLC检测丹参毛状根的丹酚酸成分含量。
将所测得的数据用Excel软件分析，分析数据结果表明由发根农杆菌A4，LBA9402，15834诱导的丹参毛状根迷迭香酸和丹酚酸B含量均无明显差异，由A4，LBA9402诱导的毛状根与15834诱导的丹参毛状根总丹酚酸含量有显著差异，见图3，表1。
由图3和表1中的数据可以看出，由发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根总酚酸类化合物含量高，由15834诱导的丹参毛状根总酚酸类化合物含量最低。从生长状态上三者诱导的毛状根差异不明显。因此，这3种发根农杆菌相比较，发根农杆菌LBA9402和A4较适宜诱导丹参毛状根。
3.2 培养基对丹参毛状根丹酚酸含量影响
将丹参毛状根LBA9402-1转接到不同液体培养基MSOH，MS，B5，6，7-V中培养，HPLC测定样品丹酚酸含量，主要是RA和SAB进行了含量测定，见图4。将测得的数据用Excel软件分析，分析数据结果表明由MSOH液体培养基培养的丹参毛状根与B5，MS，6，7-V培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量有显著差异，见表2。
从图4和表2的数据可以看出，由MSOH液体培养基培养的丹参毛状根RA，SAB和总丹酚酸化合物含量均最高。另外毛状根在培养过程中4种培养基培养的丹参毛状根生长状态也不尽相同，由B5，MS培养基培养的丹参毛状根繁殖率低；6，7-V培养基培养的毛状根繁殖率较高，但是毛状根比较短，成簇状；MSOH培养基培养的毛状根繁殖率最高，生长状态最好，因此，MSOH液体培养基最适宜培养丹参毛状根。
3.3 pH对丹参毛状根丹酚酸含量影响
根据2.1和2.2结果将由LBA9402诱导的MSOH液体培养基培养的丹参毛状根接种到不同pH的MSOH液体培养基中培养，HPLC测定各样品的丹酚酸含量见图5。
从图5的数据可以看出，MSOH液体培养基在pH≤3.99的时候不利于毛状根的丹酚酸含量的累积，当4.51≤pH≤6.01时，毛状根的丹酚酸含量较高，在pH为5.81时丹酚酸含量达到最高，说明pH为5.81的MSOH液体培养基最适宜培养丹参毛状根。毛状根在培养21 d后培养液中的4.84≤pH≤5.21，趋于相对稳定的状态。
4 讨论
本实验将实验室保种的发根农杆菌15834，A4，LBA9402侵染丹参无菌苗叶片并诱导出丹参毛状根，这3种毛状根生长形态上并无差异，但是它们的水溶性酚酸类化合物含量差异比较明显，由LBA9402和A4诱导的丹参毛状根丹酚酸含量较高，15834诱导的丹参毛状根丹酚酸含量最低。引起这种差异的原因可能是由于发根农杆菌的致根特性与其所带Ri质粒的类型有关[11]。杨世海等用发根农杆菌菌株LBA9402，R1601感染甘草，LBA9402比R1601表现出较强的感染力。胡萝卜和大白菜上，农杆碱型菌株比黄瓜碱型菌株致根力强[12]。在柑橘的离体转化中，发根农杆菌A4菌株的致根力较R1000大，而15834的致根力最弱。桔梗叶片更适于接受pRi2659菌株的侵染，而pRi15834，pRiA4诱导能力较低。由此可见，植物种类不同，适用的发根农杆菌菌株也不同[11]；需要积累的目的化合物不同，适用的发根农杆菌也会有所不同。
在以上工作基础上，将LBA9402诱导的丹参毛状根转接到MSOH，MS，B5，6，7-V等4种不同液体培养基中培养，以MSOH液体培养基培养的丹参毛状根RA，SAB和总丹酚酸含量最高，生长状态最好，最适宜培养丹参毛状根，分析原因可能是与培养基的组成成分有关，如MSOH培养基中使用的是1 g·L-1的水解酪蛋白，而MS培养基中使用的是NH4NO3。梁明等对青蒿素的研究也表明培养基中的氮源是影响青蒿毛状根产生青蒿素的一个非常重要的因素[12]，沈双等对培养基中不同营养元素对丹参毛状根生长及丹参酮积累的影响的研究也表明NH4NO3既不利于丹参毛状根的生长，同时也不利于丹参酮类成分的积累和释放[13]。
此外，还将毛状根接种到不同pH的MSOH液体培养基中培养，发现MSOH液体培养基在pH为5.81时最适宜培养丹参毛状根，分析原因可能是液体培养基的pH影响锰（Mn）、铁（Fe）、铜（Cu）、钙（Ca）等矿物质元素的存在状态及其吸收代谢，还严重影响磷酸盐的吸收。研究表明，pH偏酸性时，DNA的合成增加，当pH上升时，DNA的合成迅速降低，最终影响到根系对元素的吸收；pH还对在毛状根生长和代谢中起关键作用的酶的活性有影响，还可能通过影响酶和底物的解离状态而对毛状根的生长繁殖及代谢起作用[14]。在研究中还发现丹参毛状根在培养21 d后培养液中的4.84≤pH≤5.21，趋于相对稳定的状态。分析原因可能是毛状根把一部分次生代谢产物释放到培养基中，因此培养液中的pH处于相对平稳的状态。杨睿等发现，水母雪莲毛状根生长及总黄酮生物合成的最适pH为5.8，过高和过低的pH都不适合水母雪莲毛状根总黄酮形成[12]。黄花烟草发根培养物在16 d生长期内，质量提高35倍，向培养基中分泌的尼古丁高达10 g·L-1，Rhodse等在发酵罐中的培养黄花烟草的毛状根可向培养液中释放目的产物烟碱[15]。
本研究成功建立了丹参毛状根诱导及培养体系，并对丹参毛状根的培养条件及其次生代谢产物累积规律进行了初步研究。该试验结果表明，由发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根在pH为5.81的MSOH液体培养基中培养时丹酚酸含量较高，为利用生物技术方法来改良丹参品质奠定基础。
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